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六合宝典 > 工程技术论文 > 化学工业论文 > 荧光微球免疫层析技术定量检测抗缪勒氏管激素方法的确定

荧光微球免疫层析技术定量检测抗缪勒氏管激素方法的确定

作者:李思慧,林伟强,魏赵延,吴凯

地址:(江苏正大天创生物工程有限公司,江苏泰州 225300)

2019-09-17 13:52:09 字体:   打印 收藏 

摘 要:利用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式,依据双抗体夹心原理,制备抗缪勒氏管激素免疫层析试纸条;并从灵敏度、特异性、精密度、稳定性等方面进行全面的方法学评价。利用免疫荧光层析法建立抗缪勒氏管激素(AMH)检测试剂盒,并对试剂盒的各项指标进行评价,建立一种能够定量检测血清抗缪勒氏管激素的荧光微球免疫层析方法,用于评估卵巢储备,并对试纸条进行性能评估。结果表明,试剂盒的线性范围为0.10~20 ng/mL,线性相关系数r≥0.990,检出限不高于0.10 ng/mL,重复性检测结果的变异系数CV小于15%,批间差检测结果的变异系数CV小于20%,试剂盒特异性高,与FSH和LH无交叉反应,有效期大于12个月,且与罗氏AMH试剂盒的相关性良好,回归方程为Y=0.9957X+0.0019,R2=0.999 7。免疫荧光层析法能有效的检测血清中抗缪勒氏管激素的含量,该方法稳定性好,具有良好的应用前景。

关键词:抗缪勒氏管激素;定量检测;免疫荧光层析法

  抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)又称为缪勒氏管抑制物(Mullerian inhibiting substance,MIS),是男女性腺功能重要的标志,在性腺的发育过程中起着重要作用。对于男性而言,AMH产生于睾丸支持细胞,抑制缪勒氏管的发育,从而产生诱导男性生殖管道[1];对女性而言,AMH由卵巢的窦前和小窦状卵泡的颗粒细胞产生,其可抑制始基卵泡的启动,并抑制窦卵泡对卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的敏感性,对卵泡的发育进行调节[2]。   AMH能在月经周期中相对稳定存在,且不受激素和避孕药的影响,其检测便于临床应用[3-5]。抗缪勒氏管激素水平检测能更早且准确地反映卵巢储备功能,从而预测绝经年龄,同时在卵巢相关疾病(例如卵巢早衰、多囊卵巢综合症、卵巢颗粒细胞瘤等的诊断)和儿童性别发育异常的诊断及辅助生殖技术(ART)中有重要意义[6]。常用的方法有免疫细胞化学检测、放射免疫分析技术和ELISA检测技术,这几种检测技术都有着明显的缺陷[7]。本文中采用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式制备了能定量检测抗缪勒氏管激素的免疫荧光层析试纸条,兼具胶体金试纸条与荧光标记技术检测的优点,能够方便携带、即时检测且灵敏度高,便于在基层医院进行推广。   1 材料和仪器   AMH抗原、标记抗体抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体、捕获抗体抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体及羊抗鼠IgG多克隆抗体购自杭州博茵生物,硝酸纤维素膜(包被垫)、玻璃纤维素膜(标记物垫)、吸水纸、PVC底板购自上海捷宁生物,EuropiumChelate微球购自Bangs/深圳市纽邦生物科技有限公司,各类缓冲液(包括样品垫处理液、封闭液、保存液、复溶液、划膜稀释液等)试剂均为国产分析纯,HM3030型三维划膜喷金仪购自上海金标生物科技有限公司,干式荧光免疫分析仪为苏州和迈精密仪器有限公司,电化学发光法检测AMH试剂盒来自罗氏。   2 方法   2.1 荧光微球标记物的制备   样品垫预处理:用XYZ三维划膜喷金仪将样品垫处理液喷于玻璃纤维长条上,喷量为4 μL/cm,喷后将玻璃纤维放置于烘箱内,干燥温度37 ℃,过夜干燥。取0.2 μm微球1 mL加入1 mg NHS和1 mg EDC,室温反应3 h,加入300 μg标记抗体抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体,反应1 h以上。加入90 μL BSA封闭液,反应1 h以上。14 000 r/min,4 ℃,离心10 min,弃上清,加入300 μL 0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)复溶沉淀,4 ℃保存。然后用荧光微球标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体溶液喷涂经预处理的样品垫,喷量为4 μL/cm,喷后将样品垫放置于烘箱内,干燥温度37 ℃,过夜干燥,干燥结束后,收集密封保存。   2.2 膜处理   将另一株捕获抗体抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体及羊抗鼠IgG多克隆抗体分别用磷酸盐缓冲溶液进行稀释,用划膜喷金仪在NC膜上按照1 mg/mL的浓度进行划膜,含有捕获抗体抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体的作为检测线(T线),含有羊抗鼠多克隆抗体的作为质控线(C线),然后在37 ℃,湿度<30%的环境下过夜干燥,待用。   2.3 组装   将样品垫、制备标记垫、制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3~5 mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。   3 性能评估   3.1 灵敏度实验   取赋值的AMH企业标准品稀释配制不同浓度的AMH校准品(0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL),用制备的抗缪勒氏管激素试纸条进行依次测定,每个浓度重复5次,以0 ng/mL作为空白对照。以抗缪勒氏管激素浓度为横坐标,荧光读数仪检测信号为纵坐标,建立标准曲线。   3.2 精密度   抽取3个批次的AMH检测试纸条,分别用浓度为0.5 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的质控品进行检测,每个浓度点平行测定15次,计算3个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数。   3.3 特异性(交叉试验)   分别用含200.0 IU/L FSH、200.0 IU/L LH的0 ng/mL的AMH液进行检测,了解与AMH有无交叉反应。   3.4 稳定性   将成品试剂条放置在干燥的库房中保存,每个月测试浓度为2 ng/mL(±30%)和8 ng/mL(±30%)的企业质控品,测试期为14个月。   3.5 临床样本检测   在医院采集50份检测AMH的全血样本,用罗氏的电化学发光法检测AMH试剂盒与本试剂盒进行比较,对两种方法检测结果

期刊简介

名称:生物化工

主办:江西省科学院

期刊简介:

《生物化工》杂志是经国家新闻出版广电总局批准创办、国内外公开发行的自然科学学术期刊。于2015年8月由江西省科学院主管主办,江西热处理技术与装备杂志社出版的生物工程与化学化工领域专业学术期刊。本刊为正规性、专业性极强的双月刊。更多>>

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